IPS诱导肠类器官的培养历程可分为三个主要阶段：人多能干细胞的培养、内胚层的分化及中/后肠模式诱导、以及最终的类器官培养。本文将重点讨论第三个阶段——类器官培养。

一、准备工作

在进行类器官培养之前，需要准备以下试剂和材料：

• 人正常肠类器官培养试剂盒（编号：abs9545）
• 基质胶（低因子、无酚红）（编号：abs9495）
• 15ml离心管（编号：abs7102）
• 15ml EP管若干（编号：abs7119）
• 24孔细胞培养板（编号：abs7035）
• 金属冰盒

二、操作流程

1. 加胶、点板、加液

这是整个类器官原代操作的关键步骤。

（1）准备工作：基质胶需在金属冰盒中于4℃冰箱内融化过夜，离心管和枪头需在-20℃提前预冷至少半小时。融化后的基质胶可在4℃中保存，建议在两周内使用完毕。

（2）接种和点板：在24孔板（abs7035）中，每孔添加25μl基质胶和500-750μl的类器官培养基。

（3）混合和细胞沉淀：将细胞团与基质胶轻轻混合（避免产生气泡），并在金属冰盒或冰上进行操作，建议在半分钟内完成。

（4）培养：将培养板放入37℃培养箱中，约40-60分钟后固化，再添加500-750μl的类器官培养基进行培养。一般在10-14天后，大多数类器官的直径可达到200μm-500μm，此时可进行传代操作。

2. 类器官传代

根据类器官的情况，传代可分为两种情况：

（1）类器官数量较多或体积较大

类器官的收集与洗涤需要特别小心。详细步骤如下：

1. 使用移液器吸去旧培养基，添加4℃类器官传代培养缓冲液G，轻柔打散基质胶，收集于15ml离心管中。
2. 进行洗涤，再次添加缓冲液，冷藏处理以软化基质胶。之后进行离心，选择适当的离心机，以促进类器官与基质胶的有效分离。

（2）类器官数量不足或体积较小时

收集、吹打和洗涤流程与上述相似，但需要更细致的处理以确保细胞团的复合度。

3. 冻存技巧

冻存时要注意，类器官在指数增长期进行冷冻，通常选择传代后的第3至第4天进行冻存。收集后进行洗涤和离心，然后添加冻存液，将其轻柔重悬并立即进行冻存。

4. 复苏步骤

实验前需将水浴锅预热至37℃，并做好消毒措施。取出冻存管后迅速解冻，添加缓冲液轻柔混合后进行离心，最后接种到培养板中。

关键注意事项

• Matrigel操作需全程在冰上进行，以避免早期固化。
• 细胞应确保达到85-90%的融合，以利于球状体的形成。
• 生长因子的应用应新鲜配置，避免反复冻融影响活性。
• 严格进行无菌操作，并定期检测支原体污染。

通过严格遵守这些操作流程并对细节进行优化，可以高效生成功能性人类肠道类器官，适用于疾病建模和药物筛选等多种研究。而南宫28NG相信品牌力量，将为您的科学研究提供值得信赖的支持！