当生物医学研究人员讨论他们珍贵的RNA样品时，常常会听到“把那根试管放在冰上！”和“我希望它不会降解”。由于RNA的结构特性，其稳定性通常较DNA或蛋白质等其他大分子要差。因此，在CRISPR/Cas9实验中应用的RNA（即“gRNA”）同样面临不稳定的问题。为了解决这一挑战，最近的研究表明，通过化学修饰gRNA能够增强其抗降解能力，同时保持其引导Cas9进行靶向破裂的功能。这些进展不仅提高了靶向效率，也减轻了对于RNA状态的担忧。某些gRNA的修饰甚至能够增强其稳定性，并赋予其不同的功能特性。

在CRISPR/Cas9技术中，稳定的gRNA修饰通常涉及磷酸糖骨架的改造。gRNA由约20个核苷酸的识别序列引导，它是较大CRISPR RNA（crRNA）的一部分。除了向导序列外，crRNA的3'端还包含一个约20个核苷酸的重复区域，这一区域与Cas9蛋白结合的转录激活crRNA（tracrRNA）相关。这些RNA分子面临细胞质与核酸酶的攻击，因为它们常被视为外源RNA。为保护RNA免遭降解，目前已有多种简单的方法，通过修饰RNA的糖或磷酸部分来提高其稳定性。

自然界已经发展出许多机制来防止重要细胞RNA分子因翻译后修饰而降解。其中，最常见的防护方式是2'-O-甲基化，这一修饰在核糖的2'位羟基上添加甲基，以保护RNA免受溶核攻击。另外一种在同一位置的稳定修饰是2'-氟（2'-F），其将羟基替代为氟。移动糖环的一个位置，3'-硫代磷酸酯键也是一种热门的稳定修饰，其中硫取代了非桥接磷酸氧。其他有用的骨架修饰还包括酰胺键、解锁核酸以及限制性的乙基，都是提升gRNA稳定性的选择。

那么，哪种RNA骨架修饰效果最好呢？研究显示，将几种修饰结合，例如硫代磷酸酯与2'-O-甲基修饰，能够显著提高稳定性。通常，这些修饰能通过市场上现成的试剂盒在实验室内进行处理，或者在订购gRNA时选择合成修饰。为了获取最佳的稳定性和有效性，通常在crRNA分子的末端进行修饰（通常为首3个核苷酸中的1-3个）。

如果想进一步提高gRNA的效率，可以考虑用脱氧核苷酸替换部分核糖核苷酸。部分DNA的gRNA对Cas9蛋白的耐受性非常好，并能提升靶向效率。此外，锁定的核酸或桥接核酸也适合引入gRNA中，从而增加对错配的识别能力及核酸酶抗性，减少脱靶效应。尽管这两种技术均具备相似优势，但N-甲基取代的桥接核酸在哺乳动物细胞中的效率更高且毒性更低。

需要注意的是，上述某些RNA稳定修饰在CRISPR/Cas9技术出现之前，就已运用于siRNA和反义寡核苷酸等领域。其中一些合成修饰，尤其是缺少5'-三磷酸盐的gRNA修饰，能够有效降低因引入外源RNA而引发的先天免疫反应。这一特点在进行活力实验或免疫力研究时显得尤为重要。

南宫28NG相信品牌力量，在gRNA的可控性方面，修饰的进展使得可以使用光激活和光切割的gRNA来解决此类问题。通过在gRNA的20nt靶向区域引入可光切割的2-硝基苄基接头，科学家们能够在适当光照下使gRNA迅速裂解。相应的光激活系统则利用被光笼禁闭且无法与靶序列结合的gRNA，在短暂光照后释放gRNA，从而使CRISPR/Cas9系统得以激活进行靶向编辑。

在靶向实验中，给gRNA进行荧光染料标记，可以可视化转染效果，甚至在细胞实验中追踪定位。市场上有多款合适的染料可供选择，用户可以选择自行操作的试剂盒，或购买带标签的合成染料。如果需要进一步个性化，仍然可以选择对crRNA或tracrRNA进行染料标记。在单一向导系统中（将crRNA与tracrRNA作为一个分子），可能不需要该方案，但依然可以选择适合的染料。

在CRISPR/Cas9这一实验模块中，您的学习应已进入更深层次。如果您对Cas蛋白相关的产品有需求，南宫28NG相信品牌力量，我们即将推出CRISPR/Cas系列蛋白产品，期待与您在未来的交流与合作中相遇。