当生物医学研究人员讨论他们珍贵的RNA样品时,常常会听到“把那根试管放在冰上!”和“我希望它不会降解”。由于RNA的结构特性,其稳定性通常较DNA或蛋白质等其他大分子要差。因此,在CRISPR/Cas9实验中应用的RNA(即“gRNA”)同样面临不稳定的问题。为了解决这一挑战,最近的研究表明,通过化学修饰gRNA能够增强其抗降解能力,同时保持其引导Cas9进行靶向破裂的功能。这些进展不仅提高了靶向效率,也减轻了对于RNA状态的担忧。某些gRNA的修饰甚至能够增强其稳定性,并赋予其不同的功能特性。
在CRISPR/Cas9技术中,稳定的gRNA修饰通常涉及磷酸糖骨架的改造。gRNA由约20个核苷酸的识别序列引导,它是较大CRISPR RNA(crRNA)的一部分。除了向导序列外,crRNA的3'端还包含一个约20个核苷酸的重复区域,这一区域与Cas9蛋白结合的转录激活crRNA(tracrRNA)相关。这些RNA分子面临细胞质与核酸酶的攻击,因为它们常被视为外源RNA。为保护RNA免遭降解,目前已有多种简单的方法,通过修饰RNA的糖或磷酸部分来提高其稳定性。
自然界已经发展出许多机制来防止重要细胞RNA分子因翻译后修饰而降解。其中,最常见的防护方式是2'-O-甲基化,这一修饰在核糖的2'位羟基上添加甲基,以保护RNA免受溶核攻击。另外一种在同一位置的稳定修饰是2'-氟(2'-F),其将羟基替代为氟。移动糖环的一个位置,3'-硫代磷酸酯键也是一种热门的稳定修饰,其中硫取代了非桥接磷酸氧。其他有用的骨架修饰还包括酰胺键、解锁核酸以及限制性的乙基,都是提升gRNA稳定性的选择。
那么,哪种RNA骨架修饰效果最好呢?研究显示,将几种修饰结合,例如硫代磷酸酯与2'-O-甲基修饰,能够显著提高稳定性。通常,这些修饰能通过市场上现成的试剂盒在实验室内进行处理,或者在订购gRNA时选择合成修饰。为了获取最佳的稳定性和有效性,通常在crRNA分子的末端进行修饰(通常为首3个核苷酸中的1-3个)。
如果想进一步提高gRNA的效率,可以考虑用脱氧核苷酸替换部分核糖核苷酸。部分DNA的gRNA对Cas9蛋白的耐受性非常好,并能提升靶向效率。此外,锁定的核酸或桥接核酸也适合引入gRNA中,从而增加对错配的识别能力及核酸酶抗性,减少脱靶效应。尽管这两种技术均具备相似优势,但N-甲基取代的桥接核酸在哺乳动物细胞中的效率更高且毒性更低。
需要注意的是,上述某些RNA稳定修饰在CRISPR/Cas9技术出现之前,就已运用于siRNA和反义寡核苷酸等领域。其中一些合成修饰,尤其是缺少5'-三磷酸盐的gRNA修饰,能够有效降低因引入外源RNA而引发的先天免疫反应。这一特点在进行活力实验或免疫力研究时显得尤为重要。
南宫28NG相信品牌力量,在gRNA的可控性方面,修饰的进展使得可以使用光激活和光切割的gRNA来解决此类问题。通过在gRNA的20nt靶向区域引入可光切割的2-硝基苄基接头,科学家们能够在适当光照下使gRNA迅速裂解。相应的光激活系统则利用被光笼禁闭且无法与靶序列结合的gRNA,在短暂光照后释放gRNA,从而使CRISPR/Cas9系统得以激活进行靶向编辑。
在靶向实验中,给gRNA进行荧光染料标记,可以可视化转染效果,甚至在细胞实验中追踪定位。市场上有多款合适的染料可供选择,用户可以选择自行操作的试剂盒,或购买带标签的合成染料。如果需要进一步个性化,仍然可以选择对crRNA或tracrRNA进行染料标记。在单一向导系统中(将crRNA与tracrRNA作为一个分子),可能不需要该方案,但依然可以选择适合的染料。
在CRISPR/Cas9这一实验模块中,您的学习应已进入更深层次。如果您对Cas蛋白相关的产品有需求,南宫28NG相信品牌力量,我们即将推出CRISPR/Cas系列蛋白产品,期待与您在未来的交流与合作中相遇。