类器官（Organoids）是由干细胞或多能干细胞培养与分化而形成的三维结构。这些结构能够在一定程度上模拟真实器官的形态与功能。在类器官实验中，判断其成熟度以及选择合适的时间进行传代是确保实验成功的关键步骤。本文将为您介绍如何判断类器官的成熟程度以及类器官的传代流程。

一、判断类器官成熟的标志

1. 形态学观察

成熟的类器官通常表现出均匀的大小和规则的形状。例如，肠道类器官通常具有囊状结构，而脑类器官可能呈现神经球状结构。一般情况下，正常人类肠道类器官在培养第12至14天时，可判断为适合传代。成熟的类器官还应具备分层或分区的复杂结构，如肠类器官的隐窝-绒毛和脑类器官的皮层样分层，这些特征均可通过显微镜观察得出。

2. 细胞组成

成熟的类器官应包含多种细胞类型。例如，肠道类器官中需要包括肠上皮细胞、杯状细胞、潘氏细胞等。可以通过免疫荧光染色或流式细胞术检测细胞标志物（如Lgr5+干细胞和MUC2+杯状细胞）来进行判断。此外，成熟类器官中的细胞应完成充分的分化，表达成熟细胞标志物（如肠类器官中的Villin以及脑类器官中的NeuN），通过蛋白质免疫印迹（WB）可确认其表达的生物标志物。

3. 功能检测

功能性测试包括分泌功能、代谢活性和神经类器官的电生理活动等。可以检测类器官的分泌功能（例如肠道类器官的黏液分泌、胰腺类器官的胰岛素分泌）、代谢活性（如ATP生成和氧气消耗率），以及其是否展现出预期的功能（如肠类器官的CFTR活性或心脏类器官的自律跳动）。

4. 基因表达分析

使用qPCR或RNA测序技术分析类器官中与成熟相关的基因表达水平，如分化标志物和神经元特异性基因。此外，也可以检测类器官的DNA甲基化和染色质状态，以确定其是否接近体内成熟组织的特征。

二、类器官传代流程

1. 判断何时进行传代

通常在以下情况下需要进行类器官的传代：当类器官直径达到200-500μm，或生长速度明显减缓时；培养基颜色变化为黄色时；或者类器官的结构变得不规则，出现中心坏死现象时，应尽快进行传代。

2. 传代步骤

收集类器官时使用移液器轻轻吹打培养基，以将类器官从基质胶中释放出来，再转移至离心管中。加入适量的消化酶，轻轻吹打以使类器官解离成小细胞团或单细胞，消化时间根据类器官类型和消化酶浓度调整，通常为5-15分钟。通过添加含血清的培养基终止消化反应，并用移液器轻轻分散细胞团。接着，以300-500g离心5分钟后弃去上清，用新鲜培养基重悬细胞团。将细胞团与基质胶混合后接种到预热的培养板中，待基质胶凝固后，加入类器官培养基，最后将培养板放回37°C、5% CO₂的培养箱中继续培养。

注意事项：

• 控制消化时间，避免过长或过短导致细胞损伤或解离不完全。
• 确保使用高品质的基质胶，以便其均匀分布。
• 根据类器官类型选择适宜的培养基成分（如Wnt、R-spondin、EGF等生长因子），以保证正常分化。
• 严守无菌操作规程，以防止类器官受到污染。

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